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一种快速高通量检测转录因子活性的新方法--告别实验室苦力

作者:admin 信息来源:达科为 日期:20210827 打印 字体:  
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转录因子通过与DNA结合来调节基因表达,从而控制细胞分裂、代谢、凋亡和DNA修复等重要过程。因为它们可以控制改变细胞内基因表达,所以转录因子是研究人员非常感兴趣的。研究蛋白质-DNA相互作用的科学家经常依赖于WB或电泳迁移实验(EMSAs),这种方法基于蛋白质-DNA复合物和非复合物DNA在非变性条件下电泳迁移的相对差异,这些实验方法步骤较多,耗时较长,通常需要放射性标记的探针。基于此,Genie公司发布了一种基于96孔板比色法的实验产品,在该方法中,感兴趣的TF首先与包被在板底的含有蛋白结合共识序列的寡核苷酸结合,孵育识别TF抗体后,通过酶显色方法来确定转录因子的活性。
 

 

 

比色法试剂盒与传统的方法对比 
 

从CHO-1细胞和经过PMA(可以诱导AP-1 TF的活性)处理的CHO-1细胞中获取核提取物,利用传统的凝胶迁移方法和比色法同时检测,凝胶位移分析显示TF-DNA复合物的形成,通过放射性标记的DNA迁移率的变化来证明,但确定经处理和未处理的提取液之间的带强度差异是有一定困难的(图a)。相比之下,用比色法试剂盒检测结果可发现不同处理组之间的差异非常清晰(图b)。
 

 

 比色法试剂盒的应用 
 

通过加入刺激剂或抑制剂来评价TF结合能力的差异是比色法试剂盒的一个特征。这个特点可以用于药物快速高通量的筛选。不同浓度的TNF-α激活NF-κB p65,分别用200 ng/ml TNFα和50 ng/ml TNFα处理HeLa细胞30分钟和120分钟后,制备核提取物,然后评估NF-κB TF与其共识序列结合的相对变化。在低浓度时,TNFα使NF-κB活性增加了27倍以上,而在高浓度时,TNFα使NF-κB活性增加了50倍以上(图a所示)。

 

同样,通过测量了COS-7细胞中缺氧诱导因子-1α (HIF-1α)的激活。HIF-1α TF与肿瘤进展有关,通过泛素化途径抑制进展的治疗使其稳定。2,2-dipyridyl是一种铁螯合剂,可防止HIF-1α泛素化。用2,2-dipyridyl处理COS-7细胞17 h后,制备核提取物,然后测定HIF-1α TF与其一致序列的结合。与未处理的细胞相比,2,2-dipyridyl处理17 h后COS-7细胞的HIF-1α TF结合DNA的能力增加了3倍以上(图b)。
 

 

Genie Transcription Factor Activity Kit(比色法)特点

 

01、选择灵活性:细胞&核裂解物,磷酸化转录因子或者WT转录因子

 

02、操作简单:整个孵育过程只需5h左右

 

03、快速筛选:转录因子抑制剂或激活剂的高通量筛选

 

04、特异性高:高度验证的抗检测有活性的TF,排除与相近TF家族成员发生交叉反应

 

05、指标丰富:可提供数以百计的指标。

 

Genie厂家生产的Transcription Factor Activity Kit试剂盒提供了一种快速、高效及高灵敏度的检测方法来评价转录因子结合与其相对应的DNA的能力。该系列试剂盒通过了多种类型实验验证,数据稳定可靠,使用简单快捷,可有效地将研究人员从繁重的实验室劳动中解放出来。

 

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