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如何提高噬菌体展示文库的库容?

作者:admin 信息来源:达科为 日期:20210819 打印 字体:  
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噬菌体展示技术将基因型和表型统一于同一噬菌体颗粒,相较于传统的抗体制备技术,提供了不经免疫制备抗体的可能,可以解决因为弱抗原、自身抗原、具有毒性的抗原等抗体制备的困难。因此也是目前抗体库制备中应用十分广泛的一项技术。

一个好的噬菌体抗体库需要具备较大的容量和良好的多样性,如果库容量较小,则难以获得高亲和力的抗体。那么想要获得较大库容和多样性丰富的噬菌体文库,有哪些可以优化的因素呢?
 

一、选择高转化效率的大肠杆菌(感受态细胞)

噬菌体文库的库容会受大肠杆菌转化效率的限制,选择高效率的电转感受态细胞,能有效的增加噬菌体文库的库容,另外也可以通过增加转化次数来累积库容。在噬菌体展示文库构建过程中,使用比较多的感受态细胞有TG1、XL1-Blue、SS320等。

在进行转化实验时,要想获得高的转化效率,质粒/连接产物的纯度、电转的条件、质粒/连接产物的加入量以及操作的规范性也是需要注意的地方。


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二、辅助噬菌体投入量的优化及改造

噬菌体扩增的最终目的是将噬菌粒中单一拷贝的抗体片段基因通过噬菌体的扩增过程变成10-100个拷贝。不同文库大小的噬菌体库在扩增过程中需要的扩增体积是不一样的,要想获得大库容的噬菌体文库,以下条件需要提前进行计算评估。

1、扩增过程中含有噬菌粒的大肠杆菌的数目和体积;

2、对应加入多少辅助噬菌体进行有效感染(一般辅助噬菌体和TG1的比值MOI在10-20:1时能保证所有的TG1被感染上);

3、扩增后加入多少含有噬菌粒的噬菌体进行淘选(如果辅助噬菌体的展示效率只有10%,那最后要保证噬菌体抗体库中每个抗体有10-100个抗体拷贝数的话,辅助噬菌体的投入量就应该是文库大小的100-1000倍)


注:辅助噬菌体在TG1处于对数生长期时有比较好的感染效率,TG1处于对数生长期的OD600值在0.4-0.8。(1OD代表的菌浓度为1×109个/ml)。

 

另外,亚博全意甲也可以选择展示效率较高的辅助噬菌体,比如gIII基因缺失的Hyperphage(Progen, cat#PRHYPE),它能使得抗体或多肽在噬菌体展示的拷贝数增多(up to 5 vs. 0.01) ,从而提高淘选的效率。


 

 

三、采用体内重组技术进一步增加噬菌体文库的库容和多样性

Cre-loxp体内重组系统可以有效增大抗体库的库容性,并且在对文库进行的每一轮筛选中,所有的抗体都可以再次进行重组,保证了抗体库的多样性,因此该技术也为高容量抗体库的发展提供了有利的工具。近期,YUAN DONG[1]等利用CreLoxP重组技术构建了人源的scFv噬菌体文库,并对antiPCSK9抗体进行了筛选。

 

参考文献

[1] YUAN DONG, FANWEI MENG,et.al. Construction and application of a human scFv phage display library based on CreLoxP recombination for antiPCSK9 antibody selection. INTERNATIONAL JOURNAL OF MOlecular medicine 47: 708-718, 2021.


 

Lucigen(美国)公司成立于1998年,提供各类用于分子生物学研究相关产品,可以使研究者成功克隆较难克隆的基因。2017年Lucigen成为Epicentre Technologies基因组试剂盒、酶和辅助试剂的独家经销商。前年该公司被英国LGC收购,统一改名为Biosearch Technologies。目前产品线主要包括:体外转录、基因克隆(BAC克隆试剂盒)、感受态细胞(TG1噬菌体文库构建感受态)、体外扩增、转座子突变、蛋白表达、核酸提取、BHQ®探针、Stellaris®RNA FISH等。


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