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凝胶电泳和染色方法应该如何选择?

作者:admin 信息来源:达科为 日期:20210813 打印 字体:  
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凝胶电泳是生命科学研究中常规使用的分离和分析带电大分子的核心分子技术。可以根据蛋白质和核酸片段的大小、电荷或构象分离和纯化大分子。尽管凝胶电泳方法通常作为随后PCR的分析方法进行,但在印迹、克隆、DNA测序和其他各种下游应用之前,作为制备技术也有很多成功的案例。


凝胶盒是装满缓冲液的容器,一端为阴极(负极),另一端为阳极(正极),并配有外部电源。凝胶既是反对流介质,也是筛分介质,首先将凝胶浸没在缓冲液中,其孔靠近阳极。然后使用移液器,将样品上样至凝胶孔中。当打开外部电源时,向缓冲液施加电场,使带电分子通过凝胶向相反末端(即朝向阳极)移动。根据分子的大小,它将以不同的速率和距离通过基质。较小的分子将比较大的分子更快地通过凝胶基质迁移,最小的分子移动最远。


 


、凝胶电泳的类型


两种最常见的凝胶电泳方法包括用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳和用于分离蛋白质、500个碱基对或更少的核酸片段的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),下表总结了琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳之间的关键差异。


 

二、分离后DNA样品的可视化


通过电泳分离后,可以使用几种不同的方法显示核酸片段。最广为人知的核酸片段可视化方法是用溴化乙锭(EtBr)染色。但是, EtBr具有高度致癌性、细胞毒性和致突变性且其对环境有害,必须谨慎使用和处理。EtBr的更安全替代品包括新型凝胶染色剂,如Gelite™Safe 10,000X水溶液、Gelite™ Safe 10,000X DMSO溶液,以及凝胶染色试剂盒,这些凝胶染色剂和试剂盒不仅致突变性低于EtBr,而且Gelite™Safe可以检测琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的核酸,灵敏度更高,背景干扰更小。

 

Gelite™ Safe-更灵敏和更稳健的DNA凝胶染色液


Gelite™Safe是一种极其灵敏和稳定的荧光染料,用于电泳凝胶中DNA的可视化。与高毒性EtBr不同,Gelite™ Safe危害更小、无细胞毒性和无致突变性,并且与EtBr和SYBR®Safe相比其灵敏度更高、背景荧光更低。Gelite™ Safe强大的DNA结合亲和力允许DNA在电泳前或电泳后染色而不脱色,并且由于Gelite™Safe对DNA具有特异性,即使样品中存在RNA也不会出现非特异性结果。Gelite™ Safe在280nm和513nm处具有最大荧光激发波长,并且在552nm处具有最大荧光发射图谱。这些独特的光谱特性拓宽了Gelite™ Safe的仪器兼容性,包括UV和蓝光透射仪、凝胶记录系统和激光扫描仪,并且其单一配方,允许使用绿色或红色通道进行检测。


图1.在TBE缓冲液的1%琼脂糖凝胶,使用Gelite™Safe、EtBr和SYBR®Safe检测DNA的比较。从左到右以100ng、50ng和25ng的量上样1kb DNA Ladder,根据生产商推荐的浓度,用Gelite™Safe、EtBr和SYBR®Safe对凝胶染色60min,并使用ChemiDoc™成像系统(Bio-Rad®),配备GelGreen滤光片的300nm透射仪对凝胶进行成像。

 

Gelite™ Safe使用方法—适用于“胶染”和“泡染”两种方法

 

1. 工作溶液的制备

用您选择的pH范围为7.5-8.5的缓冲液(例如,TAE、TBE或TE,首选pH8.2)稀释10,000X储存溶液,制备1X Gelite™安全工作溶液。

注:在水中制备的染色溶液的稳定性低于在缓冲液中制备的溶液,必须在24小时内使用,以确保最大的染色灵敏度。

 

2. 染色方法

胶染

a.使用标准方案制备琼脂糖凝胶溶液。

b.在倾倒凝胶之前,将10,000XGelite™Safe储备试剂以1:10,000稀释到凝胶溶液中,并充分混合。

c.根据您的标准方案进行凝胶电泳。

泡染

a.根据您的标准方案进行凝胶电泳。

b.将凝胶置于适当的聚丙烯容器中。轻轻加入足量的1X染色溶液浸没凝胶。

注:不要使用玻璃容器,因为它会吸附染色液中的大部分染料。

c.在室温下轻轻震荡凝胶约30-60min。避光保存染色容器。

注:无需脱色。无需任何清洗步骤即可采集图像。

 

三、分离后蛋白样品的可视化


对于蛋白质,可以使用显色化学反应或染料结合方法实现可视化。确定使用哪种方法在很大程度上取决于实验条件和预期的下游应用。检测凝胶中蛋白质的常用策略包括考马斯亮蓝染色、银染、锌染和荧光染料染色。虽然考马斯亮蓝染料和银染方法在总蛋白谱分析中仍然非常流行,但荧光染料染色方法提供了更高的灵敏度和线性动态范围。


 

BioSci® SpectBlue Protein Staining Reagent-考马斯亮蓝替代快速染液


一款快速、高灵敏、低背景、低毒的考马斯亮蓝替代液。本产品不含甲醇、乙酸及三氯乙酸,配方环保,无刺激性气味,脱色时不需要使用有害溶剂。可用于SDS-PAGE 胶中蛋白质的快速染色,无需有毒的脱色液处理。本产品灵敏度高,最少只需15 分钟即可观察到10 ng 的蛋白条带,适当延长染色时间可进一步提高灵敏度。染色结束后可立即观察到清晰的蛋白条带,使用纯水脱色可进一步降低背景,提高信噪比。

 

现 货 供 应


核酸染料

 

蛋白染液

 
 

美国AAT Bioquest Inc. 公司致力于光谱学检测领域,包括吸收(颜色)、荧光和发光技术,其产品帮助全世界的科学家和生物医药研究者更好的了解生物化学、免疫学、细胞生物学和分子生物学等领域。达科为是AAT的国内一级代理商,为您提供更完善的售前售后技术支持。



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