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提高BAC,Fosmid文库拷贝数,您只差了一支诱导剂

作者:admin 信息来源:ob游戏 日期:20190610 打印 字体:  
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      还在纠结“单拷贝克隆产量低,高拷贝克隆稳定性差”这个问题吗?现在只需一支诱导剂就可人为控制质粒的拷贝数啦!

      首先安利一下Epicentre的专利技术——CopyControl™克隆系统,能够让您共享单拷贝和高拷贝的优点。CopyControl™克隆:首先以单拷贝形式生长,单拷贝可以确保插入稳定及成功克隆编码基因序列;在需要的时候,通过诱导液诱导成高拷贝克隆,以便下游应用所需。这一系统可以用来构建PCR克隆,对于BAC,Fosmid文库等大型质粒格外有用。

CopyControl™克隆系统有两个重要成分,相辅相成,缺一不可:

1.CopyControl™ pCC1和pCC2载体

pCC1和pCC2载体含有两个复制起始位点:单拷贝的大肠杆菌F-因子复制子和诱导型的高拷贝oriV。其中OriV的启动,需要trfA基因产物,由CopyControl™的另一个重要成分——TransforMax™ EPI300 E.coli菌株提供。


图1 pCC1载体图谱

2.TransforMax™ EPI300 E.coli

这是一种工程菌株,含有受诱导启动子控制的trfA基因,在诱导的条件下可以提供启动oriV所需要的trfA基因产物。 


图2 TransforMax™ EPI300 E.coli菌株基因型

 

CopyControl™克隆诱导步骤

1、将目标DNA片断连接到已经线性化、去磷酸化的CopyControl™ pCC1 Vector上。

2、转化TransforMax™ EPI300 E.coli感受态细胞,涂皿,在氯霉素LB培养基上筛选。(在这种条件下,trfA基因的表达被抑制,克隆以单拷贝数量生长。)

3、挑选单克隆,进行培养。

4、加CopyControl™ Induction solution到管中,诱导TransforMax™ EPI300宿主细胞内trfA基因的表达,从而启动oriV,克隆由单拷贝转化为高拷贝。

5、用常规方法从诱导细胞内分离DNA。


图3 CopyControl™克隆流程

 

相关产品信息

      美国Lucigen公司成立于1998年,提供各类用于分子生物学相关产品,可以使研究者成功克隆较难克隆的基因,其在2016年收购了Illumina旗下Epicentre产品线。目前产品类别主要包括:体外转录、基因克隆(BAC克隆试剂盒)、感受态细胞(TG1噬菌体文库构建感受态)、体外扩增、转座子突变、蛋白表达、文库构建等。

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