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如何做好逆转录PCR(一)——影响逆转录的重要因素

作者:admin 信息来源:ob游戏 日期:20190606 打印 字体:  
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逆转录PCR ( RT-PCR )

逆转录PCR (RT-PCR )具有灵敏性高、操作简单等优点,常用于基因定量分析、生物学检测和克隆特定基因的cDNA序列等方面。

cDNA的合成是RT-PCR 的重要环节。以mRNA为模板,在逆转录酶的催化下,随机引物、oligo(dT)或基因特异性引物的引导下合成互补的DNA(complementary DNA,cDNA),再按照普通PCR的方法设计两条引物,以cDNA为模板,则可扩增出不含内含子的完整基因的序列。

逆转录PCR 的重要因素

不同的mRNA转录成cDNA的效率不同,适合某一种mRNA转录的条件可能对另一种mRNA不适合,因此,在进行不均一mRNA反转录时,下面的参数非常重要。

一、逆转录酶

常见的逆转录酶有四大类:

  • 第一种来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒(AMV),由两条肽链组成,具有聚合酶活性和很强的RNase H活性,它最适温度是42℃,最适pH8.3。在高反应温度时可消除mRNA的二级结构对逆转录的阻碍,因此适合用来扩增比较复杂的模板,但是由于AMV具有高水平的RNase H的活性,RNaseH同反转录酶相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链,并降解RNA(RNase H可特异性消化DNA-RNA杂合链中的RNA),被降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物,所以AMV不适合太长片段cDNA的合成。

  • 第二种来源于鼠白血病病毒(MMLV),它是单肽链的,有RNA聚合酶活性和相对较弱的RNase H活性。该酶最适反应温度为37℃,最适pH为7.6。由于具有较弱的RNase H活性,因此使用该酶能得到较长的cDNA片段(2-3kb),但是MMLV对热的稳定性差。

  • 第三种来自Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶,在Mn2+存在下,可以高温进行反转录,以消除RNA模板的二级结构。

  • 第四种是MMLV反转录酶的RNaseH-突变体,此种酶与其它酶相比,能更多的将RNA转录成cDNA。这一特性使得研究者能从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板中合成较长的cDNA。

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  1. 是一种重组的MMLV反转录酶,降低了RNase H的活性;

  2. 该酶能够高效的从长的RNA模板合成全长cDNA;

  3. 比其他MMLV逆转录酶具有明显高的活性;

  4. 该酶能够从低至50 pg的总RNA中合成cDNA;

  5. 试剂盒中含有10X RT Reaction Buffer和100mM DTT;

二、合成 cDNA的引物

合成cDNA的引物一般分为三大类:

  • 随机引物:某些特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列,比较难以转录成全长序列时,可采用非特异的随机引物来转录全长mRNA。选择这种引物,体系中所有RNA分子会全部充当DNA第一链模板,然后PCR引物在下游扩增过程中再扩增特异的目的基因。通常,用此引物合成的cDNA中,96%来源于rRNA。

  • Oligo(dT):绝大多数真核细胞的mRNA具有3’端Poly(A+)尾,所以使用Oligo(dT)仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%,所以用这种引物合成的cDNA比随机引物得到的cDNA量少、复杂性小。

  • 特异性引物:以目标RNA互补序列的寡核苷酸作为引物,用此类引物仅生成所需要的cDNA,产生PCR产物更为特异。

三、缓冲液及dNTPs

缓冲液中的离子浓度会影响各种模板的转录效率。一般情况下,用钾离子比用钠离子可获得较长的转录产物。另外,使用高浓度、高纯度的四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)对于有效合成cDNA也是特别重要的。

逆转录PCR选择一步法还是两步法

RT-PCR 的实验操作分为“一步法”与“两步法”两种:

一步法RT-PCR 能克隆微量mRNA而不需合成cDNA,省略了cDNA与PCR之间的过程。两步法RT-PCR首先用反转录酶合成cDNA,然后以cDNA为模板进行PCR,即RNA 反转录与PCR 扩增分两步进行。

一步法RT-PCR与两步法相比快速、简便、减少了污染机会、减少了RNA二级结构、减少了PCR 反应的错配率。两步法RT-PCR的优势在于可获得中间产物cDNA,便于保存;且第二步PCR只需取逆转录反应产物的1/10进行反应,有利于PCR条件的调整,便于重复试验;两步法可以在第二步PCR反应体系中加入特异性引物,其灵敏度比一步法高;两步法的实验预算要低于一步法。但是由于两步法包括第一链cDNA合成和随后的PCR反应,容易产生污染问题。

下一篇我们将分享逆转录PCR实验过程中注意的问题与解决方案,敬请期待哦~

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