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简单快速获得多形核粒细胞(PMNs)的方法

作者:admin 信息来源:达科为 日期:20211008 打印 字体:  
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多形核粒细胞(PMNs),主要是中性粒细胞,同时包括少量嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。


PMNs是血液循环中最丰富的白细胞,是对组织损伤和感染的第一反应细胞。在绝大多数情况下,面对病菌入侵PMN都能做出适当的反应,以保持体内平衡和机体健康。PMNs的浮力密度往往比单核细胞大得多(>1.085 g/ml),但是在利用分离液分离的过程中会遇到一个问题,就是红细胞的浮力密度往往在1.09 - 1.11 g/ml之间,这使得使用密度分离液从全血中分离PMNs变的很困难。


Serumwerk Bernburg AG 生产的Polymorphprep分离液的高渗透压可使红细胞失水而缩小,从而增大红细胞的有效浮力密度,同时分离液中的葡蔗糖能促使红细胞聚集并在溶液中快速沉降,随着离心过程红细胞会被逐渐沉降到底部,所以利用Polymorphprep分离液可以快速有效的获得PMNs。

 

红细胞在Polymorphprep中分离的过程


多形核粒细胞分离操作步骤:

1、血液样本的制备。

为了达到最好的效果,使用抗凝全血,如EDTA,肝素或柠檬酸。EDTA 抗凝效果最佳。

2、将5毫升血液+ 5毫升分离液放入15毫升试管中,下层是分离液上层是血液。

3、500-550g离心30分钟,温度在18°C-22°C(允许转子在没有刹车的情况下减速)

4、离心后,可以看到两圈白膜层。上面PBMCs,下层是PMNs, 小心吸取PMN。

为使PMNs恢复正常渗透压,应加入1体积的0.45% NaCl溶液或0.5体积正常浓度的培养基进行稀释。如需进一步稀释,可使用生理盐水或培养基。

5 、将细胞悬浮液转移到一个15ml的试管中,加入2ml PBS, 400 g离心10分钟(18-22°C),也可以被重悬在培养基中完成后续实验。


注意事项:

1、该分离液仅适用于人的未作稀释的血液,不适用于动物血液。

2、建议使用两小时内的新鲜血液,待分离血液和待用分离液的温度需要保持在18度-22度之间。

3、注意离心时间越长或离心力越大,会导致PMN进一步向红细胞处迁移。

4、这里使用15ml离心管,推荐用5 ml血液+ 5 ml分离液进行密度梯度离心,若使用50ml离心管,建议使用 18 ml 血液+18 ml Polymorphprep™。

 

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参考文献:

1.http://diagnostic.serumwerk.com/products/polymorphprep/

2.Noah Fine 1, Nikola Tasevski The Neutrophil: Constant Defender and First Responder Front Immunol  2020 Sep 24;11:571085.  doi: 10.3389/fimmu.2020.571085.

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