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五分钟,学会最简单最完整的脾脏淋巴细胞分离方案!

作者:admin 信息来源:达科为 日期:20210901 打印 字体:  
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淋巴细胞(lymphocyte)是由淋巴器官(包括淋巴结、脾脏以及胸腺)产生的体积最小的白细胞。主要存在于淋巴管中循环的淋巴液中,是机体免疫应答功能的重要细胞成分,是淋巴系统几乎全部免疫功能的主要执行者,是对抗外界感染和监控体内细胞变异的一线“士兵”。淋巴细胞是一类具有免疫识别功能的细胞系,按其发生迁移、表面分子和功能的不同,可分为T淋巴细胞(T细胞)、B淋巴细胞(B细胞)和自然杀伤(NK)细胞。
 

脾脏是机体重要的免疫器官之一,含有大量的淋巴细胞,占全身淋巴组织总量的25%,在小鼠中,由于小鼠血液量少,从外周血液中分离大量淋巴细胞较为困难,故经常需要从其鼠脾脏中获取大量的淋巴细胞。传统淋巴细胞方法分离存在诸多不足,比如分离液本身存在细胞毒性,分离者需要自行调节分离液密度梯度,分离所得细胞活率不高、状态不好、纯度不够等。鉴于此,亚博全意甲物公司开发了一种小鼠淋巴细胞分离液(货号7211011),本分离液具有完全化学惰性、无生物毒性的碘化物,不会结合任何已知的生物功能蛋白,不会干扰任何细胞表面膜蛋白,不抑制酶活性,不会干扰抗原抗体反应等多优势,并且能同时适用于小鼠外周血和脾脏组织中淋巴细胞的分离,分离操作十分简单(小白看一遍都能学会)。

 

操作步骤

 

1. 断颈处死小鼠,浸泡于 75% 的乙醇中。

2. 在超净格尔木取出小鼠脾脏。注意无菌操作。

3. 在 35mm 培养皿中放入 4mL-5mL 小鼠淋巴 细胞分离液(取用前恢复至室温并摇匀)。研 磨(研磨操作请参考图二)。

4. 把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到 15mL 离心管中,如图一(A),覆盖 500μL-1000μL 的 RPMI 1640 培养基(保持液面分界明显), 如图一(B)。

5. 室温,水平转子 800g 离心 30min。设置较慢 的加速度和减速度,如果有十档,设为第三 档。离心结束后细胞分层如图一(C)所示。

6. 吸出淋巴细胞层,再加入 10mL RPMI 1640 培养基,颠倒洗涤。室温,250g 离心 10min 收集细胞。

7. 倾倒上清液,用培养液重悬细胞,计数。

 

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注意事项

☆ 若小鼠饲养时间较长,或者小鼠脾脏异常肿大,导致研磨后细胞悬液呈现暗红色时,须将细胞悬液 用小鼠分离液等体积稀释并混匀后,再进行第 4 步操作。☆ 分离液易挥发,每个脾脏的研磨时间应控制在 5min 以内。☆分离液南通后,请尽量保存在 2℃-8℃环境,避免因液体挥发造成分离液密度变化,影响分离效果。

 

大鼠脾脏淋巴细胞分离操作:因大鼠脾脏较大,只须剪取一小部分进行实验即可,研磨与分离的方法与小鼠脾脏淋巴细胞的分离 操作完全相同。


小鼠/大鼠/兔子血液中淋巴细胞分离操作:

1.新鲜采集的小鼠/大鼠/兔子抗凝血液 0.5mL-3mL 用 RPMI 1640 或 PBS 稀释一倍(血液稀释后分离 效果更佳,注意无菌操作)。

2.在 15mL 离心管中加入 3mL 淋巴细胞分离液。小心地将经过稀释的血液平铺在淋巴细胞分离液液 面上层,避免两种液体界面混合。

3.室温,水平转子 800g 离心 15min-20min。设置较慢的加速度和减速度(如果有十档,设为第三档)。

4.后续步骤与小鼠脾脏淋巴细胞分离操作相同。

 

特别说明——关于小鼠脾脏研磨的达科为方法:


 

☆ 推荐使用尼龙网,因为尼龙网更柔韧。

☆ 推荐使用注射器活塞来研磨脾脏。

☆ 关键所在,利用尼龙网向上的反弹力来控制研磨的力度, 将细胞可能受到的机械损伤降低到最小。

 

注意:

1.控制研磨力度,使尼龙网保持悬空,避免在皿底上直接 研磨而造成大批细胞死亡。

2.平皿的口径不能太大,否则尼龙网不能产生有效的弹力。

3.镊子在一边夹住尼龙网,防止尼龙网在研磨过程中滑动。

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